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明膠酶譜實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一
點(diǎn)擊次數(shù):765 更新時間:2022-12-23
    細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是由大分子構(gòu)成的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。為細(xì)胞的生存及活動提供適宜的場所,并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。
  基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成份,需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子,是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶?;|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)主要降解IV型膠原,基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的成分。基質(zhì)金屬蛋白酶的失調(diào)是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。
  明膠酶譜實(shí)驗(yàn)可以檢測MMP2和MMP9的活性,是分子生物學(xué)的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性,在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠,最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色,再脫色,在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶,條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
  酶譜法的基本過程是先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性,在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠,最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色,再脫色,在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶,條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
  復(fù)性原理:在電泳過程中,SDS與樣品中的MMPs結(jié)合(當(dāng)然是可逆性結(jié)合),破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發(fā)揮其分解明膠的作用,而只有當(dāng)將膠置Trition中洗脫(最好是放在搖床上搖,30min/次,做2次或15min/次,4次。靜置于Trition中是不妥的。)時,由于SDS被Trition結(jié)合而去除,從而使MMPs恢復(fù)了活性。

滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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